数值孔径和分辨率

显微镜物镜的数值孔径是衡量其在固定物体（或标本）距离下工作时聚集光线和分辨精细标本细节的能力的指标。成像光波穿过标本并以倒置锥体的形式进入物镜，如图 1(a) 所示。白光由宽光谱的电磁波组成，其周期长度在 400 到 700 纳米之间。作为参考，重要的是要知道 1 毫米等于 1000 微米，1 微米等于 1000 纳米。绿色光的波长范围以 550 纳米为中心，相当于 0.55 微米。如果通过显微镜观察小物体（例如安装在显微镜载玻片上的典型染色标本），入射到这些微小物体上的光会发生衍射，从而偏离原始方向（图 1(a)）。物体越小，入射光线的衍射就越明显。数值孔径越高，进入物镜前透镜的斜射线就越多，从而产生分辨率更高的图像，使更小的结构更清晰地可视化。图 1(a) 所示的是一个简单的显微镜系统，由物镜和样本组成，样本被准直光束照射，如果没有使用聚光镜，情况就是这样。样本衍射的光呈现为半角 () 的倒锥体，这代表可以进入物镜的光的极限。为了增加显微镜的有效孔径和分辨能力，添加了聚光镜 (图 1(b)) 以在样本的照明侧产生射线锥。这使物镜能够收集更大衍射角产生的光线，从而提高显微镜系统的分辨率。物镜和聚光镜的孔径角之和称为 工作孔径。如果聚光镜孔径角与物镜匹配，则可以获得最大分辨率。

为了能够比较两个物镜并获得分辨率的定量控制，数值孔径或物镜覆盖的立体角的测量值定义为：

其中α等于物镜开角的一半，η是物镜和保护标本的盖玻片之间使用的浸没介质的折射率（空气为η=1;油或玻璃为η=1.5）。通过检查上式，显然折射率是实现大于 1.0 的数值孔径的限制因素。因此，为了获得更高的工作数值孔径，必须增加物镜前透镜和标本盖玻片之间介质的折射率。标准显微镜物镜可获得的最高孔径角理论上为 180 度，因此数值孔径公式中使用的半角值为 90 度。90 度的正弦等于1，这表明数值孔径不仅受孔径角限制，还受成像介质折射率限制。实际上，只有性能最高的物镜才能达到超过 70 到 80 度的孔径角，而这些物镜通常要花费数千美元。

光学显微镜的分辨率定义为样本上两点之间的最小距离，该距离仍可区分为两个独立的实体。分辨率与显微镜的有效放大倍数和样本细节的感知极限直接相关，尽管它在显微镜中是一个有点主观的值，因为在高放大倍数下，图像可能看起来不清晰，但仍可以最大程度地解析物镜和辅助光学元件。由于光的波动性质以及与这些现象相关的衍射，显微镜物镜的分辨率由能够进入前透镜的光波角度决定，因此该仪器被称为衍射受限。这个限制纯粹是理论上的，但即使是理论上理想的物镜，没有任何成像误差，其分辨率也是有限的。
如果物镜将细节投射到中间图像平面上，其分辨率小于人眼的分辨率（这种情况在低放大倍数和高数值孔径下很常见），观察者将错过图像中的细微差别。如果图像被放大到超出图像的物理分辨率，就会出现空放大现象。出于这些原因，对观察者来说，有用的放大倍数最好高于物镜数值孔径的 500 倍，但不能高于数值孔径的1000倍。


提高显微镜光学分辨力的一种方法是在物镜前透镜和盖玻片之间使用浸没液。大多数放大倍数在 60 倍至 100 倍（及更高）之间的物镜都设计用于浸没油。使用折射率为η = 1.51 的油可获得良好的效果，该折射率与玻璃的折射率精确匹配。通过这种方式可消除从物体到物镜的路径上的所有反射。如果不使用这个技巧，反射总是会导致盖玻片或大角度情况下的前透镜上的光线损失（图 2）。

物镜的有用数值孔径以及分辨力会因上述反射而降低。物镜的数值孔径在一定程度上也取决于光学像差的校正量。高度校正的物镜在相应放大倍数下往往具有更大的数值孔径，如表 1 所示。

当来自标本各个点的光线穿过物镜并重新组合成图像时，标本的各个点在图像中显示为小图案（不是点），称为艾里斑。这种现象是由光线穿过标本中的微小部分和空间以及物镜的圆形后孔时发生衍射或散射引起的。两个小物体仍被视为独立实体的极限被用作显微镜分辨能力的度量。达到此极限的距离称为显微镜的有效分辨率，表示为d0。分辨率是一个可以根据仪器的光学参数和照明的平均波长从理论上推导的值。

首先，重要的是要知道，物镜和筒镜不会将物体上的一个点（例如，金属箔上的一个微小孔）成像为具有清晰边缘的明亮圆盘，而是成像为被衍射环包围的略微模糊的点，称为艾里斑（见图 3(a)）。中间像平面附近的衍射图案的三维表示称为点扩展函数（图 3(b)）。艾里斑是艾里图案的第一个最小值所包围的区域，包含约 84% 的光能，如图 3(c) 所示。点扩展函数是艾里斑的三维表示。

分辨率可根据 19 世纪末恩斯特·阿贝 (Ernst Abbe) 提出的著名公式计算，该公式表示光学显微镜的图像清晰度：

其中λ为光的波长， η表示如上所述的成像介质的折射率，组合项 η▪ SIN(α)称为物镜数值孔径 (NA)。显微镜中常用的物镜的数值孔径小于 1.5，将上式中的项α限制为小于 70 度（尽管新的高性能物镜非常接近此极限）。因此，当使用数值孔径为 1.40 的物镜时，最短实用波长（约 400 纳米）的理论分辨率极限在横向尺寸上约为 150 纳米，在轴向尺寸上接近 400 纳米。因此，使用显微镜无法在横向平面上分辨距离小于此距离的结构。由于成像介质的折射率和物镜的角孔径之间的相互关系具有重要意义，Abbe 在解释显微镜分辨率的过程中引入了数值孔径的概念。

艾里斑中的衍射环是由物镜孔径的限制功能引起的，因此物镜充当一个孔，衍射环位于其后。物镜和聚光镜的孔径越大，d0就越小。因此，整个系统的数值孔径越高，分辨率就越好。与原始阿贝公式相关的几个方程式之一，用于表达数值孔径、波长和分辨率之间的关系：

其中λ是光的成像波长， NAcon是聚光镜数值孔径，NA obj等于物镜数值孔径。系数 1.22 取自下图中所示的两个艾里斑接近时的计算结果，其中强度分布已叠加。如果两个图像点彼此相距较远，则很容易将它们识别为单独的物体。但是，当艾里斑之间的距离不断减小时，当第二个艾里斑的主最大值与第一个艾里斑的第一个最小值重合时，就会达到极限点。叠加的分布显示两个亮度最大值，它们之间有一个谷值。谷底的强度与两个极大值相比降低了约 20%。这刚好足以使人眼看到两个独立的点，这一极限被称为瑞利判据。

比较一下可能有助于理解这一点。电话线不太可能用于小提琴微妙声音的电子传输，因为这种介质的带宽非常有限。如果使用高质量的麦克风和放大器，其频率范围与人类的听觉范围相同，则可以获得更好的效果。在音乐中，信息包含在中等声音频率中；然而，声音的细微差别包含在高泛音中。在显微镜中，结构的细微之处被编码到衍射光中。如果您想在物镜后面的成像空间中看到它们，您必须确保它们首先被物镜收集。随着孔径角的增大和数值孔径的增大，这变得更容易。
物镜的数值孔径随着放大倍数的增加而增加，最高可达 40 倍（见表 1 和表 2），但对于油浸版本，数值孔径在 1.30 和 1.40 之间稳定（取决于像差校正程度）。表 2 列出了研究和教学实验室中常用物镜的分辨率计算值。表中列出了样本的点对点分辨率d0，以及中间目镜平面（使用 550 纳米波长的绿光）中图像的放大尺寸 (D0)。此外，表中的n值表示如果它们沿 20 毫米的视场直径排列成线性阵列（20/D0毫米），则解析像素的数量。

如果物镜在低数值孔径下无法提供足够的像素，则不应尝试使用提供高附加放大倍数（例如 16 倍、20 倍或 25 倍）的目镜或其他光学后燃器来增加显微镜的整体放大倍数。另一方面，如果物镜将非常精细的细节投射到中间图像上，并且您使用的是放大倍数较低的目镜，您将错过细微的差别。为了在光学显微镜中观察精细的标本细节，标本中存在的微小特征必须具有足够的对比度，并以略大于人眼角分辨力的角度投射中间图像。如前所述，显微镜的整体组合放大倍数（物镜和目镜）应高于 500 倍，但低于 1000 倍物镜孔径。该值称为有用放大倍数的范围。
在日常的常规观察中，许多显微镜专家并不会尝试用他们的设备实现尽可能高的图像分辨率。显微镜的分辨率是光学系统最重要的特性，它会影响区分特定样本精细细节的能力。决定分辨率的主要因素是物镜数值孔径，但分辨率还取决于样本的类型、照明的相干性、像差校正程度以及其他因素，例如显微镜光学系统或样本本身的对比度增强方法。

现代显微镜物镜允许在实践中实现理论分辨力，前提是观察合适的标本。但是，有几个提示可以确保成功。这些提示如下。

物镜和标本是否干净？空气物镜前透镜上的指纹可能足以影响标本的高对比度图像再现，这是由于不必要的散射光造成的。同样的警告也适用于被树脂或乳液残留物（如油和水）弄脏的浸没式物镜。在这些情况下，使用软布和镜头清洁剂或纯乙醇仔细清洁物镜前透镜元件应该可以缓解问题。

盖玻片的厚度是否正确？与高孔径（大于 0.65）物镜匹配的盖玻片具有 170 微米的标准厚度至关重要，因为在设计物镜时会考虑盖玻片厚度。因此，如果使用不同厚度的盖玻片（小于 165 微米或大于 175 微米），光学图像的质量会明显受到影响。一般来说，数值孔径为 0.7 或更高的物镜的经验法则是，它们可以容忍 10 微米的变化，而数值孔径较低的物镜（0.3 到 0.7）可以容忍更高的偏差，通常高达 30 微米。

您使用的浸油正确吗？ 所有数值孔径大于 0.95 的物镜都设计用于浸没介质（通常为折射率为 1.515 的油）。浸油不含多氯联苯，几乎不显示任何自发荧光。如果浸没层中引入气泡，图像将明显受损，因此必须小心涂油以避免产生气泡。取下目镜，通过显微镜观察筒（或使用伯特兰透镜）检查物镜后焦平面，即可轻松看到气泡。如果发现气泡，应清洁物镜和载玻片，并小心地重新涂上油。